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技术文章 / article
冷冻保存细胞之法
2017-01-16 浏览次数：1851
1.DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用的DMSO等级，必须为Tissueculturegrade的DMSO(如SigmaD2650)，其本身即为无菌状况，*次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。
2.冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一:冷冻管置于4°C30-0分钟→(-20°C30分钟*)→-80°C16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3°C至–80 °C以下，再放入液氮槽vaporphase长期储存。*-20°C不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
3.细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial，融合瘤细胞则以5x106cells/mlvial为宜。
4. 应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之方法。
5.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。
6.支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。
除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
7.支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
8.侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
9.CO2培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
10.为何培养基保存于4°C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4°C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。或加入稀盐酸调整PH值。
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