★CQ★细胞培养-消化要有个度

★CQ★细胞培养-消化要有个度

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★CQ★细胞培养，尤其是细胞系的培养，就细胞消化而言，多做、善于总结，就可以把细胞养的越来越好。

★CQ★绝大部分细胞消化只要用胰酶润洗一遍即可：

吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把细胞全部消化成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了。

一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。

细胞就是*成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，你可以尝试，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。

一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液。细胞只要能从基质上脱离下来，即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右）是正常的，不要再去延长消化时间，等待单细胞悬液出现。

★CQ★比较难消化的细胞：

润洗方法5min还不能消化，以结肠癌细胞为例，比如HCT15、LS411和KM12细胞，胰酶消化，一般10 cm 培养皿，一次zui多加入300ul-500ul就足够了。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。

★CQ★常规的细胞实验，受消化影响不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外）。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态要求*。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响细胞外基质相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

许多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA联合作用。这里要明白，胰酶切割细胞外基质的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca离子，作用于整联蛋白的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果10min还消化不*的话），而应该想其它办法。

★CQ★PBS洗涤：

消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为血清中含有抑制胰酶的蛋白。对于一些难消化细胞，可以配制不含Ca，Mg离子的PBS，因为这些离子也会抑制胰酶的活性。但对于绝大部分细胞用胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化，不需要配制不含Ca，Mg离子的溶液。

每段时间定期对细胞房、培养箱&水盘、水浴锅、废液桶等容易染菌的个角落细菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好细胞房，带好手套、口罩、鞋套，防止人为因素污染。一旦发现污染，及时处理。