人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 的培养方法

人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 是从脐带静脉中分离出来的原代细胞。这种细胞是研究内皮细胞的模型系统，研究相关的低氧、炎症、氧化应激、感染反应以及正常和肿瘤相关血管生成等应用。TNF-α 和 IFN-γ 等细胞因子会诱导内皮细胞激活（一种炎性反应），并导致 VCAM-1/CD106 等细胞黏附分子上调，这些上调可使用荧光标记抗体和细胞成像进行定量，以下是人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养操作方法。

一、实验方法原理

本实验采用新鲜的健康产妇新生儿脐带，采用胶原酶Ⅰ型用消化分离得到脐静脉内皮原代细胞。胶原酶是理想的血管内皮细胞分离酶，对细胞间质有较强的消化作用，能使上皮细胞与胶原组织成功分离，且不损伤内皮细胞，分离出的血管内皮细胞数量多，杂细胞污染少，且细胞贴壁能力强。

二、实验材料    

1. 分离好的人脐带静脉内皮细胞HUVEC

2. 试剂、试剂盒    

PBS胶原酶M199培养基胰酶EDTADMEM培养基

3. 仪器、耗材    

针头手术钳离心管低温离心机弯管明胶恒温培养箱显微镜

三、实验步骤

1. 将 15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的 PBS 溶液中储存。（注：4℃下最多贮存 24 小时，室温下不超过 6 小时，否则废弃）

2. 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的 PBS 溶液冲洗 3-5 次，将污血冲洗干净为止。

3. 用手术钳夹紧脐带下端，加入 15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化 15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4. 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个 50 ml 无菌离心管中，用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带 2-3 次。

5. 将收集液离心（2000 转/ 分）3 分钟。

6. 倒去上清，加入 10ml M199 培养基（加入 10U/ml 的 bFGF） ，用弯管吹散细 胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。（注：每个培养瓶中加入 3- 4ml 无菌的 1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液* 铺满瓶底，放入 37℃孵育，最少 2 小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被 有利于细胞贴壁。 ）

7. 培养 24 小时后，倒掉培养基，并用无菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次，洗掉红细胞和死细胞，加入 10 ml 新鲜的 M199 培养基。

8. 以后每 2 天换一次培养基（每次换掉 2/3 的培养基） 。

9. 一般培养 5-7 天，细胞可长满至 80-90%单层，这时可以传代。

10. 倒掉培养基，用无菌的PBS 溶液清洗 2-3 次，加入2- 3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培养基终止反应。

11. 用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个 50 ml 无菌离心管中，2000 转/ 分，离心 3 分钟。

12. 倒掉上清，加入 10ml新鲜培基，一般一瓶细胞可传代 3-4 瓶，以后照此传代培养。

13. 一般传代 2-3 代（培养了 20 天左右）用于做各种实验效果较为好。

四、注意事项    

1. 严格进行消毒．使用三套器械取材。

2. 严格进行无菌操作，防止细菌、真菌、支原体污染，避免化学物质污染。

3. 吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；经火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷却。防止烫伤、烫死细胞。吸取液体时，避免瓶口和吸管接触碰撞。

4. 离心管入台前，管口、管壁应消毒。